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SUBPROGRAMA DE DIAGNOSTICO CITOGENÉTICO

Subcordinador: Dr. M. Odero. CIMA, Pamplona

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1. Justificación del subprograma programa

El análisis citogenético aporta una información indispensable para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de neoplasias hematológicas. El cariotipo es en la actualidad el factor pronóstico independiente más importante en muchos tipos de leucemias, y permite distinguir grupos de pacientes con distinto pronóstico, e incluso identificar pacientes con alteraciones genéticas que requerirán un tratamiento específico.

El desarrollo de técnicas de citogenética molecular, como la hibridación in situ con fluorescencia (FISH), ha tenido un gran impacto tanto en el diagnóstico como en la investigación clínica. La gran sensibilidad y especificidad de la técnica de FISH, que permite caracterizar a nivel molecular las alteraciones cromosómicas, la convierte también en una herramienta eficaz en investigación, como una primera aproximación a estudios moleculares. Además, esta técnica y sus variantes se pueden utilizar en núcleos en interfase y en muestras de parafina o congeladas de tumores sólidos. Por otra parte, en la actualidad muchos de estos análisis genéticos son indispensables para señalar y evaluar la eficacia terapéutica de fármacos dirigidos específicamente hacia la alteración genética que causa la neoplasia.

2. Objetivos

  1. Ofrecer el servicio de diagnóstico citogenético a los grupos de la red
  2. Dar soporte citogenético en la identificación y caracterización de nuevos genes relacionados con el proceso neoplásico.
  3. Desarrollar y validar nuevas técnicas diagnósticas, especialmente las que tengan un impacto pronóstico, en el análisis genético de las neoplasias hematológicas y no hematológicas.


3. Servicios que ofrece la plataforma

Desarrollo y análisis de ensayos de citogenética molecular (FISH, mFISH y FICTION) en pacientes con mieloma múltiple, linfoma, o con otras neoplasias hematológicas.

· Análisis mediante citogenética molecular de cromosomas marcadores para la detección de nuevas alteraciones citogenéticas asociadas una patología.

· Análisis y significación clínica de nuevas translocaciones cromosómicas implicadas en el desarrollo neoplásico. Identificación y caracterización de los genes implicados.

· Estandarización metodológica de estas técnicas a nivel multicéntrico para las patologías de interés.

· Definición de grupos de riesgo en los que se puedan aplicar protocolos terapéuticos específicos.

· Análisis citogenético en ensayos clínicos que promuevan componentes de los grupos de la red de cáncer

Las técnicas que se ofrecen a los distintos grupos de la red de cáncer son:

  1. Citogenética convencional de bandas G en muestras de sangre periférica, médula ósea, ganglios u otros tejidos con células neoplásicas.
  2. Hibridación in situ con fluorescencia (FISH), tanto con sondas comerciales como con sondas de diseño propio, para la detección de alteraciones genéticas numéricas y estructurales, tanto en neoplasias hematológicas como en tumores sólidos. La técnica de FISH se podrá aplicar tanto sobre tejido fresco como sobre tejido parafinado. Será de especial interés el mapeo mediante FISH de los genes implicados en translocaciones que no se han descrito previamente.
  3. Ensayos de multicolor FISH (mFISH), tanto con sondas comerciales como con sondas de diseño propio, que permiten detectar varias alteraciones en un único análisis.
  4. Hibridación genómica comparada (CGH), para la detección de alteraciones cromosómicas no equilibradas, partiendo de cualquier material tumoral del que se pueda extraer DNA. Esta metodología permite detectar alteraciones en forma de ganancia, pérdida o amplificación de material genético con una resolución de 5-10 Mb, sin la necesidad de tener un tejido con capacidad de entrar en división.
  5. Cariotipo espectral (SKY), que puede detectar alteraciones en todos los cromosomas en un único experimento.
  6. FICTION (Fluorescence Immunophenotyping and Interphase Cytogenetics as a Tool for Investigation of Neoplasms), una técnica que combina el FISH con ensayos morfológicos e inmunohistoquímicos, con el fin de analizar el patrón de alteraciones genéticas de poblaciones celulares específicas, aunque estén presentes en una minoría en el tejido que se esté estudiando.

Estas técnicas se deben utilizar en muchos casos de una forma complementaria, y se ofrecen como una herramienta que puede ser muy útil para una aproximación citogenética y molecular de los distintos proyectos que desarrollen grupos de la red de cáncer. Además, los grupos que integran el área de citogenética tienen experiencia en arrays de CGH (resolución de 0.5-1 Mb) y arrays de SNPs.


4. Tecnologías disponibles

  • Citogenética convencional mediante bandas G en muestras de sangre periférica y/o médula ósea para la detección de alteraciones cromosómicas (numéricas y/o estructurales) en el cariotipo
  • Translocación t(9;22), gen de fusión BCR-ABL (FISH y RT-PCR).
  • Translocación t(15;17), gen de fusión PML-RARA (FISH y RT-PCR)
  • Detección inv(16) y t(16;16), gen de fusión MYH11-CBFB (FISH y RT-PCR).
  • Translocación t(8;21), gen de fusión AML1-ETO (FISH y RT-PCR)
  • Reordenaciones del gen MYC en leucemias agudas linfoides linfoma de Burkitt
  • Reordenaciones del gen MLL
  • Deleciones del gen TP53 (FISH)
  • Deleciones de 13q14 (FISH) en síndromes linfoproliferativos
  • Deleciones de ATM (FISH) en síndromes linfoproliferativos
  • Detección de otras deleciones cromosómicas (FISH)
  • Detección de aneuploidías en neoplasias hematológicas y tumores sólidos (FISH con sondas centroméricas)
  • Reordenación IgH-BCL1 (FISH y PCR) en linfomaslinfoma del manto
  • Reordenación IgH-BCL2 (FISH y PCR) en linfomas
  • Reordenamiento IgH-MYC (FISH) en linfomas
  • Reordenamiento IgH-MLT, API2/MLT y BCL10 (FISH) en linfomas
  • Reordenamiento PAX5 (FISH) en linfomas
  • Reordenamiento de kappa o lambda (FISH) en linfomas
  • Reordenamiento de BCL6 (FISH) en linfomas
  • Translocación t(2;5), gen de fusión NPM-ALK (FISH y RT-PCR) en linfomas linfoma anaplásico
  • Reordenamientos con valor pronóstico (FISH) en mieloma múltiplelinfoma folicular
  • Detección de amplificación de HER2/NEU y TOP2A en cáncer de mama y en otros tumores sólidos (FISH sobre cortes de parafina)
  • UROVYSION, para cáncer de vejiga (FISH sobre muestras de orina)
  • Detección mediante FISH de alteraciones cromosómicas numéricas y estructurales con significado pronóstico en otros tumores sólidos
  • Hibridación genómica comparada (CGH) y arrays de CGH en tumores sólidos
  • Arrays de SNPs en neoplasias hematológicas y en tumores sólidos
  • Por otra parte, según los proyectos que desarrollen los grupos de la red de cáncer: Diseño de sondas de FISH mediante BACs en las regiones de interés, y diseño de análisis mediante la técnica de FICTION (inmunofenotipo y FISH)

5. Grupos que contribuyen a esta plataforma

La plataforma de diagnóstico citogenético está compuesta por tres grupos con una gran experiencia en el área de citogenética y genética molecular de neoplasias hematológicas y de tumores sólidos. Los componentes del grupo colaboran en el estudio de una temática homogénea y tienen numerosas publicaciones científicas, algunas conjuntas y en colaboración con grupos internacionales. Además, participan en proyectos de investigación relacionados con este campo, han colaborado en los estudios citogenéticos de ensayos clínicos a nivel nacional, y han promovido la propuesta y realización de controles de calidad en laboratorios que realizan diagnóstico citogenético, lo que garantiza la capacidad investigadora del grupo y la viabilidad de la actividad propuesta.

Durante la anterior convocatoria de redes ha prestado un servicio de diagnóstico centralizado a más de 100 hospitales dentro de la red de mieloma múltiple. Además, colaboran de forma habitual con centros de reconocido prestigio tanto nacional como internacional, lo que avala la capacidad del equipo para llevar a cabo este trabajo.
 

  1. Departamento de Genética/CIMA y Clinica Univesitaria de Pamplona Subcordinador del programa: MD Odero. Investigador: MJ Calasanz, Asociado al grupo de MD Odero.
  2. Hospital Clínico de Salamanca/CIC.Investigador: JM Hernandez, Asociado al grupo del Dr Jesús San Miguel
  3. Hospital del Mar/IMIM de Barcelona. Investigador: F Solé

Los servicios específicos que proporcionaran estos grupos son:

· Citogenética convencional de bandas G: Hospital Clínico de Salamanca/CIC, Hospital del Mar de Barcelona y Departamento de Genética/CIMA de Pamplona

· Hibridación in situ con fluorescencia (FISH) y ensayos de multicolor FISH (mFISH), tanto con sondas comerciales como con sondas de diseño propio: Hospital Clínico de Salamanca/CIC, Hospital del Mar de Barcelona y Departamento de Genética/CIMA de Pamplona

· Hibridación genómica comparada (CGH) y arrays de CGH: Hospital Clínico de Salamanca/CIC y Hospital del Mar de Barcelona

· Cariotipo espectral (SKY): Hospital Clínico de Salamanca/CIC, Hospital del Mar de Barcelona y Departamento de Genética/CIMA de Pamplona

· FICTION: Hospital del Mar de Barcelona

· Arrays de SNPs: Departamento de Genética/CIMA de Pamplona


6. Bibliografía

Gozzetti, A.; Le Beau, M.M. Fluorescence in situ hybridization: Uses and limitations. Semin. Hematol. 2000, 37, 320–333.

Grimwade, D.; Walker, H.; Oliver, F.; Wheatley, K.; Harrison, C.; Harrison, G.; Rees, J.; Hann, I.; Stevens, R.; Burnett, A.; Goldstone, A. The importance of diagnostic cytogenetics on outcome in AML: Analysis of 1,612 patients entered into the MRC AML 10 trial. The Medical Research Council Adult and Children’s Leukaemia Working Parties. Blood 1998, 92, 2322–2333.

Harrison, C.J. The management of patients with leukaemia: The role of cytogenetics in this molecular era. Br. J. Haematol. 2000, 108, 19–30.

Kallioniemi, A.; Kallioniemi, O.P.; Sudar, D.; Rutovitz, D.; Gray, J.W.; Waldman, F.; Pinkel, D. Comparative genomic hybridization for molecular cytogenetic analysis of solid tumors. Science 1992, 258, 818–821.

Le Beau, M.M. One FISH, two FISH, red FISH, blue FISH. Nat. Genet. 1996, 12, 341–344.

Lips EH, Dierssen JW, van Eijk R, et al. Reliable high-throughput genotyping and loss-of-heterozygosity detection in formalin-fixed, paraffin-embedded tumors using single nucleotide polymorphism arrays. Cancer Res. 2005;65:10188-10191

Martin-Subero, J.I.; Chudoba, I.; Harder, L.; Gesk, S.; Grote, W.; Novo, F.J.; Calasanz, M.J.; Siebert, R. Multicolor-FICTION: Expanding the possibilities of combined morphologic, immunophenotypic, and genetic single cell analyses. Am. J. Pathol. 2002, 161, 413–420.

Odero, M.D.; Carlson, K.M.; Calasanz, M.J.; Rowley, J.D. Further characterization of complex chromosomal rearrangements in myeloid malignancies: Spectral karyotyping adds precision in defining abnormalities associated with poor prognosis. Leukemia 2001, 15, 1133–1136.

Speicher, M.R.; Gwyn Ballard, S.; Ward, D.C. Karyotyping human chromosomes by combinatorial multi-fluor FISH. Nat. Genet. 1996, 12, 368–375.

Veldman, T.; Vignon, C.; Schrock, E.; Rowley, J.D.; Ried, T. Hidden chromosome abnormalities in haematological malignancies detected by multicolour spectral karyotyping. Nat. Genet. 1997, 15, 406–410

 
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